采用（UPLC-TQMS）方法对定量检测了蜂蜜中的王浆主蛋白（MRJPs）；
筛选出了MRJPs的定量检测特异性多肽标志物；
构建了70种真实性蜂蜜样品的MRJP1~3含量阈值数据库；
展示了真实性蜂蜜分析的内源性标志物MRJP 1~3的应用前景。
掺假掺杂是国际蜂蜜行业长期存在的问题，对蜂蜜产业的健康发展造成了极其严重的影响。现有蜂蜜掺假检测方法虽然可以有效、针对性地控制已知的掺假现象，但是缺乏对新型掺假的预警和快速反应能力，存在检测技术开发落后于掺假技术和掺假监管成本过高等缺点，导致难以彻底杜绝蜂蜜掺假现象的发生。近年来，基于蛋白组学和代谢组学的生物标志物检测技术在食品真实性检测领域的受到广泛的应用，为以蜂蜜的内源性蛋白-王浆主蛋白（Major royal jelly proteins, MRJPs）作为蜂蜜的真实性检测标志物的研究奠定了基础。但由于蜂蜜中的主蛋白含量较低，国内外迄今尚缺乏精准定量的检测可靠方法。
近年来，浙江大学食品科学与营养系沈立荣教授团队联合张进杰研究员领导的秦皇岛海关技术中心国家蜂蜜重点实验室、浙江粮油质量检测中心、杭州蜂之语蜂业股份有限公司，开展了以蜂蜜中的MRJPs为特征性标志物，利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱（UPLC-TQMS）检测技术建立了蜂蜜中主蛋白的三个主要成员—MRJP 1~3的定量分析方法系统研究。经对大量经碳同位素比值质谱法和花粉检测并判定为真实性蜂蜜样本的UPLC-TQMS检测，建立了真实蜂蜜中的MRJP 1~3含量数据库，并设置了蜂蜜真实性检测阈值。通过模拟掺假、商品蜂蜜检测，与碳同位素比值质谱法和花粉检测方法比对，验证了本方法在蜂蜜真实性检测中的有效性，为国际上精准检测和判断蜂蜜的真实性，建立新的精准检测标准提供了关键技术和依据。
Results and Discussion
王浆主蛋白MRJPs的定性鉴别
利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF)对经胰蛋白酶酶解的蜂王浆主蛋白多肽进行定性检测，以从UniProt数据库中获得的MRJPs的肽序列信息为参照，通过ProteinLynx Global Server（PLGS）软件对获得的数据进行比对分析，成功鉴定出8个王浆主蛋白（MRJP1~7和MRJP 9)的一级序列数据，共有108条多肽，其中24条属于MRJP1，28条属于MRJP2，21条属于MRJP3，14条属于MRJP4，11条属于MRJP5，3条属于MRJP6，6条属于MRJP7，1条属于MRJP9。8种王浆主蛋白（MRJPs）的多肽覆盖率分布于1.7~76.6%（表1）。
蜂蜜中MRJPs候选标志多肽的筛选
基于UPLC-TQMS对蜂蜜中所有王浆蛋白的候选多肽进行重复性检测分析，从108条候选多肽中初筛选出峰面积较高，其中重现性较好的有34条多肽。然后以多肽的易酶解性和酶解后稳定性两个指标作为合适的标志多肽筛选标准，对7种王浆蛋白的34条多肽展开分析。依据两个评判指标，将所有的候选多肽依次分成5类：A.易酶解且稳定；B.易酶解但不稳定；C.不易酶解但稳定；D.不易酶解且不稳定；E.无规律。经过从高到底等级的比较分析，最终成功为筛选出一条属于B类的MRJP 1特异性标志多肽：YNGVPSSLNVISK，属于A类为筛选出一条MRJP 2特异性标志多肽：TLQMIAGMK；属于A类一条MRJP 3特异性标志多肽：LTVAGESFTVK（表2）。
蜂蜜中MRJP 1~3定量方法的建立与方法学验证
分别合成MRJP 1~3的3条特异性标志多肽标准品及其同位素标记肽，建立了MRJP 1~3定量检测的UPLC-TQMS检测方法。并通过标准曲线、精密度、回收率,定量限分析，对所建方法进行方法学验证，结果显示符合美国临床实验室标准协会CLSI C62-A的相关要求。采用UPLC-TQMS法，对洋槐蜜、油菜蜜、荆条蜜和荔枝蜜等四种常见蜂蜜和玉米糖浆、大米糖浆和高果糖浆等三种常见蜂蜜掺假糖浆进行MRJP 1~3定量分析。结果表明，洋槐蜜、荆条蜜、油菜蜜、荔枝蜜中均含MRJP 1~3等3条特异性标志肽，在玉米糖浆、大米糖浆或高果糖浆等任何一种蜂蜜掺假物中未能检测到，证实MRJP 1~3属于蜂蜜的特异性内源蛋白。对模拟糖浆掺假蜂蜜检测分析结果表明，掺入高果糖浆的浓度与所掺入蜂蜜样品中的MRJP 1~3含量负相关（R2>0.99），证明了采用MRJP 1~3为蜂蜜内源性标志蛋白具有应用于掺假蜂蜜检测的可行性（图1）。
真实蜂蜜MRJP 1~3含量数据库的建立与应用
利用所建UPLC-TQMS方法，对经真实性验证的70个真实蜂蜜样品的MRJP1~3作定量分析，建立了包含洋槐蜜、油菜蜜、荔枝蜜和荆条蜜等四种单花蜜的MRJP1~3真实含量数据库。通过检测结果的相关性分析，这四种蜂蜜的MRJP1~3总含量间存在显著性差异，证明本方法在理论上适用于蜂蜜蜜种鉴别（表3）。
最后，以MRJP1~3真实含量数据库为依据，分别设定了四种真实性蜂蜜的MRJP 1~3含量阈值，并将本方法与UPLC-TQMS法和国标法中检测法——C-4植物糖含量的稳定碳同位素质谱法（IRMS）比对，对10个市售蜂蜜样品进行了验证性检测比较。结果两种方法对其中9个蜂蜜样品的真实性判定结果一致，证明本方法对蜂蜜真实性检测的可靠性（表4）。
Quantification of major royal jellyproteins using ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupolemass spectrometry and application in honey authenticity
Weijian Jiang1,2, Meirong Ying3 , Jinjie Zhang4 , Zongyan Cui4, Qi Chen5 , Yong Chen1, 2 , Jiajun Wang2 ，Fang Fang3, , Lirong Shen1,2 *
1. Department of Food Science andNutrition, Zhejiang Key Laboratory for Agro-Food Processing, ZhejiangUniversity, Hangzhou 310058, China. 2 Hangzhou Beewords Apiculture Co., Ltd.Hangzhou 311500, China. 3. Zhejiang Grain and Oil Product Quality InspectionCenter, Hangzhou 310012,China.4.Technical Center of Qinhuangdao Customs, Qinhuangdao 066002, China. 5. Hangzhou Pro-Solution Analysis Technology Co.,Ltd, Hangzhou 311200, China
Abstract
Major royal jelly proteins (MRJPs) have been used asendogenous biomarkers for honey authentication. However, no study onquantification of MRJPs in honey authentication was reported. In order todevelop a new honey authenticity method based on quantitative analysis of MRJPsin honey, trypsin-digested peptides from MRJPs were examined bymass spectrometry (MS). Three peptides,YNGVPSSLNVISK, TLQMIAGMK, and LTVAGESFTVK were selected as specific markers forMRJP1, MRJP 2 and MRJP3（MRJP1~3）, respectively. An ultra performanceliquid chromatography-triple quadrupole MS (UPLC-TQMS) method used for quantificationof MRJPs in honey was developed and validated. A database on the MRJP1~3contents of honey established by quantification of 70 authentic samples showed a potentialapplication in honey authenticity identification.The analysis results of 10 commercial honey samples by UPLC-TQMS with referenceto the MRJP1~3 database of authentic honey were compared and confirmed bywidely used isotope ratio mass spectrometry, a AOAC Official Method. In conclusion, the results showed ourmethod, a proteomic-based UPLC-TQMS method, has a high accuracy, sensitivityand specificity for honey authenticity.
Keywords: MRJPs; Peptide markers;Honey; Authenticity detection; MRJP1~3 database; UPLC-TQMS
该文章“Quantificationof major royal jelly proteins using ultra performance liquid chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry and application in honeyauthenticity”在线发表于《Journal of Food Composition and Analysis》，DOI https://doi.org/10.1016/j.jfca. 2021.103801。
原文见https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/ S0889157521 000016
通信作者简介
沈立荣 教授
沈立荣教授，美国哈佛大学医学院和农业部驻塔芙茨大学人类老年化研究中心访问学者（博士后），现任浙江大学食品科学与营养系教授。学术兼职主要包括美国营养学会会员、亚太临床营养学会会员、亚太素食联盟委员；中国营养学会营养转化医学分会理事、浙江省食品安全专家委员会专家、浙江省食品科技学会理事、杭州市科协常委、杭州市食品药品安全应急专家委员会副主任、杭州市食品营养学会常务副理事长、《Food Science and Human Wellness》、《Foodand-Nutritional Science》、《Annals of Nutrition and FoodScience》、《International Journal of Trends andTechnologies in Food Processing》、《Nutrition_Dietetics》、《Vegetarian Nutrition Journal》等国际期刊编委，以及《Cancer》、《Annals of Clinical Micro Journal of Nutrition and Metabolism》、《Experimental Gerontology》、《Journal ofIntercultural Ethnopharmacology》、《Acta Biochimica etBiophysica》、《Plant Foods for Human Nutrition》、《Journal of Food & Nutritional Disorders》、《Journal of Zhejiang University-SCIENCE B》、《InternationalJournal of Insect Science》等30多本国际期刊审稿人。十多次出访美国、欧洲、日本、韩国、东南亚国家和出席国际会议，包括美国营养学会大会、国际营养科学联盟大会、亚太临床营养学会大会等，并报告交流；组织国际学术会议和论坛10多次。
沈立荣教授长期从事食品营养健康与食品安全基础研究和应用开发工作，特别是在蜂王浆、蜂蜜、山茶油、姜黄的营养健康功能、质量检测技术领域取得了突出成就，如研究制订了美国药典委批准发布的《美国食品化学法典标准-油茶籽油》，在国际上率先研发成功免冷冻保存的蜂王浆主蛋白产业化技术和产品，通过动物实验证实了促生殖和改善内分泌功能。主持“863计划”、国家自然科学基金、浙江省和杭州市重大科技专项、浙江省公益性计划项目和自然科学基金项目等，国家科技支撑子项、国家重点研发计划项目子课题、新疆建设兵团重大科技项目子项等项目。包括“蜂王浆主蛋白的抗衰老作用及分子机理研究”、“基于蜂王浆功能蛋白分子机理创新研究的抗衰老保健食品产业化示范”、“山茶油功能评价与精深加工”、“以内源性特异蛋白为标记物的蜂蜜真伪鉴别技术研究与快速检测试剂开发”、“反食品欺诈库构建与食品链脆弱性评估技术研究”、“新疆梨、核桃、枣果实功能性成分形成机制及关键基因挖掘”等项目。曾获美国药典委银奖、全国优秀科普作品奖、浙江省科技进步一等奖、梁希林业科学技术奖科技进步二等奖、浙江省百名科技追梦人等荣誉。已发表SCI收录论文50多篇，获得授权发明专利20项。
JFCA浙江大学沈立荣教授：王浆主蛋白的超高效液相色谱串联三重四级杆质谱定量方法及在蜂蜜真实性检测中的应用
